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关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

ChIP实验原理

 

在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

可以利用ChIP研究转录因子( transcription factor, TF)与启动子(promoter)的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是:甲醛处理细胞——收集细胞,超声破碎——加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合——洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联,纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

 

 

ChIP实验步骤

第一天:
(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%。(培养基共有9ml)
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起,共800ul。
7、超声破碎:VCX750,25%功率,4.5S冲击,9S间隙。共14次。当然,如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。



(二)、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后,10,000g 4度离心10min。去除不溶物质。
留取300ul做实验,其余保存于-80度。
300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul 5M NaCl (NaCl终浓度为0.2M),65度处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中,加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。
10、1h后,在4度静置10min沉淀,700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体,另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。

(三)、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物,加入4ul 5M NaCl,65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天:
(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后,每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度颠转2h。
13、4度静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4度颠转10min,4度静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。
洗涤溶液:a. low salt wash buffer----one wash
b. high salt wash buffer-----one wash
c. LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15、清洗完毕后,开始洗脱。洗脱液的配方:100ul 10%SDS, 100ul 1M NaHCO3, 800ul ddH2O,共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联:每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。
混匀,65度解交联过夜。

第三天:
(一)、DNA样品的回收
17、解交联结束后,每管加入1ul RNaseA(MBI),37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA, 20ul 1M Tris.HCl(PH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
45度处理2h。
19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。

(二)、PCR分析

 

ChIP技术总结
(一)、关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。
一般细胞长到75%-80%比较好。

(二)、关于抗体!
抗体是实验成败的致命因素之一!必须是IP级别的抗体,另外如果经济条件许可的话,尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体,即使是IP级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强,背景低。但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在ChIP甲醛交联的过程中,很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题,但是多抗特异性较差,背景可能会偏高。
一般而言,如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域),选择多抗比较稳妥一些。

(三)、关于交联与超声破碎!
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果,交联的程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分,只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合,富集得到的Promoter的量不高,实验假阴性。交联过充分,基因组上结合了太多的蛋白,对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。
一般来讲,按照我的经验,交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系,交联的条件也不一样。例如:NIH-3T3的交联条件是室温(25摄氏度)下15min,1%的甲醛浓度,而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件,机器不一样,条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器,那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般,理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。

(四)、关于操作
希望尽可能的保持低温(4度)。
沉淀的时候可以先在4度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速(500rpm等)离心使其完全沉降。
虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方,我还是希望你能够连续把它做完,直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

(五)、关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够,但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里,DNA不会降解,过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。
(六)、关于DNA片段的回收
需要注意的是:样品中SDS样品较高,普通的PCR产物回收试剂盒回收,很有可能会在最终的样品中混入SDS,影响PCR实验结果。
小Tip:过柱前,在样品中加入一定量的异丙醇,能有效的消除SDS沉淀。

 

 
 
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